第一作者：朱琳

通讯作者：汪美贞

通讯单位：浙江工商大学环境科学与工程学院、浙江省固体废物处理与资源化重点实验室

论文DOI:

https://doi.org/10.1016/j.envint.2024.108902

图文摘要

成果简介

         近日，我院汪美贞教授团队在环境科学与生态学1区Top（校A+++级）期刊Environment International (IF=10.3)上发表了题为“Environmentally persistent microbial contamination in agricultural soils: High risk of pathogenicity and antibiotic resistance”的研究论文。本文讨论了农业土壤中携带“Last-resort”抗生素抗性基因(LARGs)的HBPs致病性和抗生素耐药水平。首次构建了土壤环境持久性微生物污染的综合概况，证明了环境宿主是HBPs耐药性和致病性的来源；分离的含有“Last-resort”抗生素抗性基因的人类细菌性病原体对大蜡螟(Galleria mellonella)的致死率为100 %。此外，还观察携带LARG的质粒具有较高的转移性和稳定性。结果表明，土壤环境中的致病性和对“Last-resort”抗生素的耐药性可能被低估。

全文速览

     “One Health”概念强调人类、动物和环境健康的相互联系，并提出微生物污染在这一框架内的重要性。环境中持久性微生物污染普遍存在，但其特征风险相关研究匮乏。新型污染物抗生素抗性基因(ARGs)、人类病原菌(HBPs)和毒力因子基因(VFGs)能显著共存，并引发一系列生态风险和负面健康效应。因此揭示环境宿主、人类携带者及其感染之间的联系对于了解暴露风险至关重要。尽管与临床环境和粪便中的丰度相比，农田土壤中LARGs的丰度低了几个数量级，但考虑到介质可以直接接触作物，从而使LARGs的进一步复制或转移，其风险仍旧不容小觑。

        本文讨论了农业土壤中携带“Last-resort”抗生素抗性基因(LARGs) 的HBPs致病性和抗生素耐药水平。通过定量PCR (qPCR)测定了土壤中VFGs和LARGs的绝对丰度（4.7×10⁷ gene copies/g 土壤），呈现高丰度的持久性。为了评估其宿主的关键特性，本研究采用培养依赖性菌株分离和基因分型，从土壤样本中共获得了665个对LARGs表现出耐药性的菌株，并进行了PCR和测序分析鉴定出36株携带LARGs的分离菌株。筛选出5株典型的菌株进行了SMRT测序，并研究了LARG/VFG阳性质粒和染色体的遗传特性（图1）。大多数分离的携带LARGs的HBPs对Galleria mellonella具有100 %致死率（图2）。通过对培养后15 h内携带/不携带LARG阳性质粒（质粒消除）的HBP的生长速度测定，评估了质粒pPaKPC1-2、pKpmcr12-1、pEcmcr1-3和pECX42-1对宿主生长适应性的影响。携带LARG的质粒对其宿主细菌的适应成本较低，意味着这些质粒在HBPs中的适应性很高（图3）。LARG和VFG质粒融合和核心遗传排列表明，这些连接质粒赋予了基因在（或跨）物种和环境中稳定、持久性的横向传播。

图文速览

图1. 质粒中LARGs和VFGs的遗传环境

         (A)携带blaKPC-2的质粒pPaKPC1-2的图谱。(B)携带mcr-1的质粒pPaKPC1-2的图谱。(C)携带mcr-1的质粒pEcmcr1-3的图谱。(D)VFG样质粒pECV1-2的图谱。箭头表示基因的位置和方向。Δ符号表示截短的基因。中心分别代表质粒名称、Inc组、序列长度(kb)。

图2. 基于G. mellonella的证据，证明LARG携带的HBP分离株的致病性和无效的最后防线类抗生素处理

        (A)G. mellonella感染模型示意图。(B)注射blaKPC-2阳性铜绿假单胞菌GSK002和美罗培南治疗失败的G. mellonella生存曲线。(C)注射mcr-1阳性E. coliGSM102和肺炎克雷伯菌GSM302的G. mellonella与粘菌素治疗失败的生存曲线。(D)注射携带tet(X4)奇异变形杆菌x1-1、E. coliGSX004和替加环素治疗失败的G. mellonella存活曲线。G. mellonella（三组，每组10只幼虫）以1×10⁶CFU的剂量进行对数期培养攻击，并记录感染后72小时。用PBS接种的组用作空白对照；肠道致病性E. coli O55：H7是高毒力菌株。

图3. 携带LARG质粒的适应成本和LARG过表达对细胞活力的毒性作用

         (A)去除携带LARG的质粒的示意图。(B)铜绿假单胞菌GSK002存在或不存在blaKPC-2携带质粒pPaKPC1-2的体外生长曲线。(C)肺炎克雷伯菌GSM302存在或不存在质粒mcr-1-携带pKpmcr12-1和大肠杆菌GSM102存在或不存在mcr-1-携带质粒pEcmcr1-3。(D)大肠杆菌GSX402存在或不存在tet(X4)携带质粒pEcX42-1。(E-F)用L-阿拉伯糖处理并用LIVE/DEAD® 染色的携带LARG的大肠杆菌MG1655存在或不存在的代表性共聚焦激光扫描显微镜图像。绿色和红色分别代表活细胞和死细胞。

小结

          尽管与临床环境和粪便中的丰度相比，农田土壤中LARGs的丰度低了几个数量级，但考虑到土壤介质可以直接接触作物，从而使LARGs的进一步复制或转移，其风险仍旧不容小觑。本研究显示即使LARGs丰度低于前两类样品，动物感染模型显示分离出的携带LARGs的HBPs仍具有高致病性（接近100 %的致死率），能干扰环境中“Last-resort”抗生素的有效性。此外，还观察到三种“Last-resort”抗生素以及其他重要抗生素的高水平耐药性。以上结果：1）证明了环境宿主是HBPs耐药性和致病性的来源；2）揭示了持久性微生物污染的丰度、基因环境以及生态定殖；3）提出了环境持久性微生物污染高风险、多源性、兼容性和稳定性4个指标，有助于识别环境持久性微生物污染和触发预防干预措施。阐明了在“One Health”框架下将环境微生物的表型-基因型-生态位定殖联系起来的重要性。

作者介绍

       朱琳（第一作者），副研究员，硕士生导师，主要从事环境生物污染形成与传播扩散机制、生物污染防控新技术研究。主持国家自然基金面上及青年项目、浙江省自然科学基金探索项目等、浙江工商大学“数字+”学科建设重点项目，中央高校基本科研业务费项目等；作为科研骨干先后参与国家重点研发计划、国家自然科学基金重点/面上项目等多项国家级项目，以第一或通讯作者在Environ. Sci. Technol.、Water Res.、J. Hazard. Mater.等国内外知名期刊发表SCI论文10余篇。

汪美贞（通讯作者），浙江工商大学环境科学与工程学院院长，教授，博士生导师，主要从事污染环境生物修复、群体感应调控研究。先后承担了国家重点研发计划国合项目、国家重点研发计划青年科学家项目、国家自然科学基金优青项目、国家自然科学基金联合基金重点项目等省部级以上项目18项；以第一或通讯作者在PNAS、Nat. Commun、ACS Nano等国际知名期刊上发表 SCI论文60余篇，授权国家发明专利19件。曾获浙江省“有突出贡献中青年专家”荣誉称号、教育部霍英东优秀青年教师奖、中国环境科学学会青年科学家奖等。入选国家级高层次青年人才、浙江省高层次青年人才。